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分光光度计析谱详细讲解
发布时间:2018-08-30 点击次数:1262次

分光光度计已经成为现代分子生物学实验室仪器。常用于核酸、蛋白质定量以及细菌生长的浓度。分光光度计分光光度计的简单原理和一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而导致特定波长的光源,光源透过测试的样品,部分光源被吸收,计算样品的吸光度值,转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。核酸定量核酸定量分光光度计是频繁使用的功能。可以溶解在缓冲定量寡核苷酸单链和双链DNA,RNA。核酸的吸收,吸收峰波长260 nm。每一个核酸分子是不同的,所以转换因子是不同的。不同类型的核酸定量,之前选择相应的系数。如:1 od的吸光度值50μg 毫升dsDNA,37 ssDNA毫升、40μg 毫升的RNA,30亩Olig g 毫升。后测试后的吸光度值转换系数,从而得出相应的样品浓度。在测试前,选择正确的程序,输入,和稀释剂的体积,然后测试空白和样品液体。然而,实验并非一帆风顺。阅读不稳定可能是实验者头痛的问题。仪器的灵敏度越高,显示的吸光度值漂移。事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,使吸光度值在一定范围内变化,仪器有一定的准确度和精密度。如EppendorfBiophotometer精度1.0 ?少r(1 a)所以很多变化之间的测试结果平均约1.0 ?是正常的。此外,还需要考虑物理化学性质和核酸本身溶解核酸缓冲pH值,离子浓度,如:在测试中,离子浓度过高,也会导致读数漂移,因此推荐使用pH值必须降低缓冲,离子浓度,如TE,可以极大地稳定的读数。稀释浓度的样品也是不容忽视的因素:因为不可避免地有一些微小粒子的样本,尤其是核酸样本。这些小颗粒的存在干扰的测试结果。粒子,以减少对测试结果的影响,为核酸吸收值大于0.1,至少吸光度值在0.1 - -1.5 -的。在这个范围内,粒子的干扰相对较小,结果是稳定的。这意味着样品的浓度不能过高或过低(比光度测试范围)。后操作因素,如充分混合,否则吸光度值太低,甚至消极;液体混合物不可能存在泡沫,空白没有暂停,或严重的读数漂移;必须使用相同的颜色杯测试流体和空白样品,否则浓度差太大,选择比例因子和样品浓度单位一致;不能用窗口穿比色杯,样品的体积必须满足的要求比色杯的小体积,和其他操作项目。除了核酸浓度、分光光度计和显示几个非常重要的比率表示样品的纯度,如260 280的比率,用于评估样品的纯度,因为蛋白质吸收峰是280海里。纯样品,比大于1.8(DNA)或2.0(RNA)。如果这个比率低于1.8或2.0,显示了蛋白质或酚醛树脂的影响。230表示样品的一些污染物,如碳水化合物、多肽、苯酚等纯核酸260 230比大于2.0。320年的一项解决方案的浊度和其他干扰因素。纯样品,320年一般是0。蛋白质定量方法(紫外)这种方法直接在280 nm波长,直接测试蛋白质。华宝选择公式,光度计可以直接显示样品的浓度,或者是选择相应的转换方法,吸光度值到样品浓度。蛋白质测定的过程非常简单,首先空白测试液体,然后直接测试蛋白质。由于有一些杂质在缓冲,一般想要消除\ \ \u201C背景\ \ \u201D信息320 nm,设置这个功能\ \ \ \ \ \u201D。类似于核酸测试,这就需要至少280的吸光度值超过0.1,1.0到1.5之间的线性范围。根据样品浓度选择华宝实验公式,发现阅读\ \ \u201C漂移\ \ \u201D。这是一个正常现象。事实上,只要吸光度值的变化观察到280范围小于1 ?显示,结果是非常稳定的。漂移的转换公式因为华宝吸光度值浓度,乘以一定的系数,只要有一个小变化,吸光度值浓度可以被放大,因此结果不是很稳定。蛋白质定量方法直接,适用于测试比纯,相对于一个单一的蛋白质。紫外线直接比色法,定量的方法是快速、操作简单,但平行材料易受干扰,如DNA的干扰;其他蛋白质含量低的灵敏度更高。比色法定量蛋白质蛋白质通常是多种化合物,是比色法的基础来确定蛋白质成分:氨基酸(如。、酪氨酸、丝氨酸),加上地下室或染料反应,生成有色物质。有色物质浓度直接相关的氨基酸蛋白质反应,因此反应蛋白浓度。比色法在BCA,布拉德福德,洛瑞,等几种方法。洛瑞方法:早的双缩脲反应的基础上,改进。蛋白质与Cu2 +反应,产生蓝色的反应物。但与双缩脲相比,洛瑞方法灵敏度较高。缺陷是需要订单输入不同的反应试剂,反应需要的时间较长,易受影响的非蛋白物质;包含EDTA,特里同x - 100,硫酸氨物质,如蛋白质是不适合这种方法。BCA(Bicinchoninine酸试验)方法:这是一个相对较新的和更敏感的蛋白质测试。分析蛋白质在碱性溶液中反应,Cu2 +铜+ BCA后者形成螯合,形成紫色化合物,吸收峰波长562纳米。这种化合物与蛋白质浓度极强,反应之间的线性关系后化合物的形成是非常稳定的。相对于洛瑞的方法,操作简单,灵敏度高。但如果与劳里之间方法容易受到干扰蛋白质和洗涤剂。布拉德福德法:这种方法的原理是与考马斯亮蓝反应蛋白质相结合,生成有色化合物的吸收峰595海里。其大的特点是,灵敏度好,两个测试方法是洛瑞,BCA 2倍;操作更简单、更快,只需要一个反应试剂;化合物可以稳定1小时,方便结果;一系列干扰Lowry,BCA还原剂的反应(如。、德勤、巯基乙醇)兼容的。但对洗涤剂仍敏感。的主要缺点是不同的标准将导致相同的样本差异的结果,没有可比性。一些研究人员为比色法的测定可能各种各样的比色法测量结果是不一致的,让人困惑,真的应该相信什么方法吗?由于各种方法反应组和显示不同的基组,所以与此同时,几种方法用于相同的样本的样本浓度没有可比性。凯勒等,例如,测试人类的牛奶蛋白,结果洛瑞,BCA测量浓度明显高于布拉德福德的显著差异。即使相同的样本,同样的比色方法的选择标准样品,测试后的浓度也不同意。如果用洛瑞测试细胞匀浆蛋白,与BSA作为标准,的浓度\ 1.34毫克/毫升,球蛋白作为标准,2.64毫克\ /毫升的浓度。在选择比色法,因此,的指的是测试样品的化学成分,寻找相似的化学成分标准蛋白质作为标准。此外,比色法定量蛋白质,经常出现吸光度值问题是样本过低,导致测量的浓度样品浓度与实际差距较大。关键问题是,反应后的颜色有一个半衰期,因此每个比色法列出了反应测试时间,所有的样品(包括标准样品),必须在测试。时间太长,吸光度值小,密度减少的转换。此外,反应温度、溶液的PH值等是重要的影响因素的实验。此外,它是非常重要的,使用塑料比色法。避免使用石英或玻璃杯子的颜色,因为颜色反应后,可以让一个石英或彩色玻璃,并导致样品吸光度值不准确。细菌细胞密度(OD)600实验室,以确定细菌生长密度和生长时期,更多的视觉推理根据经验和细菌的生长密度。在实验中,高需求需要一个分光光度计测定细菌细胞的密度。OD600是标准的跟踪方法在液体培养微生物的增长。后没有真菌液体培养空白,后定量文化包含细菌培养。为了确保正确操作,每个仪器都必须为每个微生物和细胞计数用显微镜,制作校准曲线。偶尔出现在细菌的OD值实验液体负面,原因是使用了显色培养基,即细菌培养一段时间后,和反应介质,颜色反应。此外,重要的是要注意,测试样品可以不离心,使细菌悬浮状态。重要的配件u2014u2014分光光度计比色杯比色杯根据材料分为石英玻璃,和塑料杯。根据不同的测量体积,比色杯和毛细管比色杯,etc.General试验定量蛋白质、核酸和紫外线采用石英玻璃或一些,但不适合比色法。因为染料的反应(如。考马斯亮蓝)可以使石英和玻璃着色,所以必须使用一次性塑料杯。和塑料杯不应使用一般的紫外线范围测试样品。由于测试样品数量是不同的,所以一般分光光度计制造商提供不同的体积比色杯,以满足不同用户的需求。已经存在一种可用于市场目前,uv定量蛋白质、核酸比色法也可以用于蛋白质测定塑料杯,剂量的样品只有50μl,比色杯单一的无菌包装,样品可以回收。如埃普多夫UVette吗?塑料比色杯,是一个比色杯的市场创新。随着生命科学及相关学科的发展,这类的科学实验和研究提出了更高的要求,分光光度计的分子生物学实验室将是必不可少的工具,也成为了微生物学,食品,医药和其他相关实验室的一个必要的设备。

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